PCR技术：PCR污染及对策

在PCR实验中，污染是一个常见且严重的问题，可能导致假阳性结果，影响实验的准确性和可靠性。为有效预防和处理PCR污染，需遵循以下注意事项：

一、实验分区与操作流程

合理划分实验区域：将实验分为标本处理区、PCR反应液制备区、PCR扩增区和产物分析区，各区域应有明确的隔离和方向性，避免交叉污染。

单向工作流程：从预PCR到后PCR，实行“单向"工作流程，确保在后PCR区域引入的耗材和防护装备不会未经消毒就回到预PCR区域。

试剂与样品分离：PCR试剂、PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或冰箱。

二、试剂与材料准备

试剂分装：所有PCR试剂应在超净工作台或负压工作台配制和分装，使用专用加样器和吸头，避免交叉污染。

试剂储存：实验室自配的试剂（如去离子水、缓冲液等）在使用前应高压灭菌或过滤除菌。

试剂小量分装：PCR试剂应小量分装，以减少重复取样次数，并置于-20℃保存。

三、实验操作规范

正确佩戴防护装备：实验过程中应戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套。

避免气溶胶污染：操作时应勤换手套，进出不同区域或进行模板操作后应及时更换手套；开管动作要轻，以防管内液体溅出或形成气溶胶。

减少操作污染：在同时进行多个PCR反应时，应制备主反应混合液，再分装至PCR反应管，最后添加样品核酸模板，以减少单个添加操作繁琐造成的污染。

使用防溅污染的吸头：使用防溅污染的移液器吸头，减少样本或试剂中的气溶胶形成

四、污染监测与处理

设立对照实验：设立阴阳性对照和空白对照，监测反应体系各成分的污染情况，选择合适的对照样品。

污染识别：使用“无模板对照"（NTC），其中NTC孔包含所有qPCR反应组件，但不包含DNA模板。如果在NTC孔中观察到扩增，可能表明反应组件中存在污染。

污染处理：若发生污染，应设立阴阳性对照监测污染情况，排除试剂污染后，考虑环境污染的可能性，通过追踪实验查找污染源，必要时更换实验场所或重新设计引物。

五、实验室清洁与消毒

定期清洁：实验结束后对操作台面、仪器、实验用具及环境进行清洁，避免污染。

消毒措施：使用10-15%的漂白溶液（次氯酸钠）擦拭表面，让漂白剂作用于表面10至15分钟后，用去离子水擦拭，最后用70%酒精浸湿的纸巾快速干燥表面。

设备消毒：定期消毒用于准备qPCR反应的表面和设备，包括工作台面、移液器、冰箱/冷冻室把手、离心机、涡旋器和其他触点。

六、污染控制技术

UNG法：使用尿嘧啶糖苷酶（UNG）去除PCR产物中的污染，优点是能去除任何来源的污染，且UNG处理可与PCR扩增在同一反应管内进行

DNase I法：采用DNase I法处理反应液污染，适用于去除污染DNA。

固相捕获法：利用生物素标记的单链RNA探针与待扩核酸杂交，再用包被链霉亲和素的固相载体捕获杂交核酸，从而去除污染

七、其他注意事项

实验记录与验证：坚持常规清洁工作，设计阴性对照组，连续三天阴性对照没有起跳，则污染得到控制。

人员培训：所有操作人员应接受严格培训，确保操作规范，减少人为污染风险。

通过以上措施，可以有效预防和处理PCR污染，确保实验结果的准确性和可靠性。