细胞培养常见问题及解决办法

细胞培养是生物医学研究中的基础技术之一，但在实际操作中，常常会遇到各种问题。以下将结合我搜索到的资料，详细列举细胞培养过程中常见的问题及其解决办法。

1. 培养液pH值变化过快

原因：CO₂张力不正确、瓶盖过紧、碳酸氢盐缓冲不足、盐浓度不正确或细菌/真菌污染。

解决办法：调整CO₂浓度、松开瓶盖1/4圈、增加HEPES缓冲液浓度、使用正确的盐和培养基、丢弃污染的培养物并尝试净化。

2. 培养液中出现沉淀

原因：残留磷酸盐、冰冻保存导致沉淀、细菌/真菌污染。

解决办法：用去离子水反复冲洗玻璃器皿并除菌，或加热培养液至37℃并摇动使其溶解，若沉淀仍存在则丢弃培养液。

3. 细胞不贴壁

原因：胰蛋白酶消化过度、支原体污染、培养液中缺乏贴壁因子。

解决办法：缩短胰蛋白酶消化时间或降低浓度、清洁支架或培养箱、调整培养液成分。

4. 悬浮细胞成簇

原因：培养液中钙、镁离子含量高、支原体污染、蛋白酶过度消化。

解决办法：使用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞、分离培养物并检测支原体、用DNase I处理细胞。

5. 细胞生长缓慢

原因：培养基配方不当、血清质量差、细胞传代次数过多、细胞老化、支原体污染。

解决办法：更换新鲜培养基、补充谷氨酰胺及生长因子、使用无抗生素培养液、增加接种细胞浓度、换用新的保种细胞。

6. 细胞死亡

原因：培养箱内无CO₂、温度波动大、细胞损伤、培养液渗透压不正确、有毒代谢产物堆积。

解决办法：检测并调整培养箱内CO₂和温度、更换保存细胞种、检测培养液渗透压、换入新鲜培养液。

7. 细胞污染

原因：细菌、真菌、支原体或病毒污染。

解决办法：丢弃被污染的细胞并消毒培养环境、使用优质血清、避免反复冻融。

8. 细胞复苏后无活细胞

原因：细胞冻存不当、复苏方法不当、复苏培养基不合适、细胞稀释过度。

解决办法：新取一只冻存细胞并储存在液氮中、按照供应商推荐的操作程序冻存细胞、使用供应商推荐的培养基、避免涡旋振荡或用力敲打培养瓶

9. 细胞复苏后贴壁不良

原因：低湿度导致静电积累、消化过度、支原体污染。

解决办法：增加室温湿度、使用防静电装置、调整消化条件、检测并清除支原体。

10. 细胞生长不均匀

原因：细胞或培养基混合不足、冲击式细胞生长不均、培养箱内温度波动。

解决办法：插入细胞后轻轻摇晃混合、使用摇床时保持连续稳定的振幅和频率、调整培养箱温度。

11. 细胞形态异常

原因：消化过度、培养基成分改变、长期继代筛选结果。

解决办法：调整消化时间、更换培养基、观察细胞状态。

12. 细胞冻存不当

原因：冻存液质量差、冻存方法不当、存储不当、解冻方法不当。

解决办法：遵循供应商建议的缓慢冷冻、使用合适的细胞保护剂、快速解冻并使用预热培养基。

13. 血清保存与使用问题

原因：血清保存不当、血清解冻方法不当、热灭活血清影响质量。

解决办法：建议在-5℃至-20℃保存，避免4℃超过一个月，分装后冷冻；逐步解冻，均匀摇晃，避免长时间置于37℃。

14. 细胞计数与存活率问题

原因：细胞计数方法不准确、DMSO毒性、渗透压伤害。

解决办法：使用台盼兰计数活细胞、立即去除DMSO、预热培养基、快速解冻。

15. 细胞传代操作不当

原因：消化过度、传代比例错误、离心过度。

解决办法：控制消化时间、调整传代密度、轻柔操作