恒温扩增技术发展现状及未来趋势

在这些恒温扩增技术中，以2000年shou次报道的LAMP法尤为耀眼和引人关注，目前占据超过60%的恒温检测市场。核酸检测对LAMP技术如此亲赖，究其原因，得益于其它恒温检测技术难以达到LAMP技术的综合性优势：

1、反应速度极快，优化的引物组合可以达到15min内检测到单copy分子，检测速度接近或超过RPA和NASBA；

能够达到超敏检测极限，1-5copy的分子能够稳定检出，稳定性高，其它任何恒温技术难以达到如此稳定的水平；

2、结果判读形式的多样化，适应各种环境和条件下的核酸快速检测。LAMP扩增作为终点判读形式，可不借助任何其它辅助设备，裸眼观察检出结果。基于钙黄绿素、HNB、红黄变色、OG橙绿变色都可以肉眼观察结果。LAMP同样可借助浊度仪进行实时浊度分析。在反应体系中加入SYBR Green荧光染料后，可使用小型恒温荧光仪进行实时检测。以上这些结果判读形式均可在野外等非标准实验室进行，所需设备简单、小巧、价格低廉、便于普及。除此外，传统实验室中的荧光定量PCR仪，同样可进行LAMP检测，可采用SYBR Green、MB探针法或LAMP TaqMan探针法，对于经常操作PCR检测的人员来讲，可以无缝对接、无需更换设备。

3、对RNA病毒的漏检率低，由于RNA病毒的突变率较高，在PCR检测中个别突变对PCR的扩增影响较大，容易造成病毒漏检的假阴性。而LAMP识别靶基因8个区段，在这些识别区段中个别的突变对LAMP扩增影响较小，不易产生漏检。

4、试剂稳定、易于使用。同RPA、NASBA等技术相比，LAMP与PCR法都采用单一酶（或双酶）系统进行反应，生产批次稳定、反应酶系统耐高温，试剂稳定性好。在检测试剂中仅包含酶mix一管、引物/探针一管，使用方便，在荧光定量PCR机器上可方便的进行高通量检测。而RPA、NASBA等系统需要多个复合酶，比例严谨、试剂稳定生产困难、保存运输条件苛刻、难以高通量应用。

5、LAMP法对耐受杂质能力强。PCR、RPA、NASBA等扩增体系均需要进行核酸纯化制备，在进行粗制品的直扩系统中，上样量均较小（<10%），无法大体积上样，杂质对这些扩增方法均影响较大。而LAMP法对大多数样本的耐受性能达到20%以上，个别样本的含量可以容忍到50%以上，如此大的上样体积量，决定了LAMP具有更高的检出率。

6、扩增反应同步病毒灭活，由于LAMP反应温度在65℃的高温条件下进行，在病毒液直扩中，反应过程中即可灭活病毒，降低耗材的污染风险。

7、高特异性，随着LAMP用酶不断改进、反应缓冲液的不断优化、探针技术的搭配、引物设计理念的不断改善，LAMP的非特异性扩增获得质的提升，目前在优化的LAMP体系中，假阳性的情况已经得到改善，假阳性比例接近甚至低于PCR方法。

8、多重荧光探针的应用。随着Bst DNA聚合酶和反应缓冲体系的不断改进、LAMP TaqMan技术的发明，多重LAMP体系得以建立。这种多重的LAMP技术，达到了金标准TaqMan PCR的多靶基因、内参质控样本的相同性能，符合到临床应用的标准。

恒温扩增技术的发展现状

自1980年PCR技术发明后，基于PCR技术的核酸检测迅速应用到临床、食品、环境的检测中，并成为核酸检测的金标准。但PCR的检测技术存在设备体积大、粗样品耐受性差、反应时间长、灵敏度难以达到单copy等诸多缺点，已经难以满足现代核酸检测的要求：速度快（<30min）、超灵敏度（1-5copy/test）、大体积粗制样品直检（20-50%反应体积样本量）、野外操作、简单化操作等方面的指标。 在过去的20年中科学家一直尝试通过恒温扩增的方法来实现上述目标，这其中包括RCA(rolling circle amplification)、LAMP(loop-mediated isothermal amplification)、RPA(recombinase polymerase amplification)、NASBA(nucleic acid sequence based amplification)、SDA(strand displacement amplification)、HDA (helicase dependent amplification)、TMA(transcription-mediated amplification)等新型核酸恒温扩增技术。