Bungarusmulticinctus金钱白花蛇PCR试剂盒实验操作规范

产品及特点    

本产品是根据探针法荧光定量 PCR 原理开发的检测试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。

2. 引物等组分经过优化，灵敏度高。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. 特异性高，引物是根据中间普雷沃菌 DNA 序列高度保守区设计，不会跟其他生物样本的DNA发生交叉反应。

5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。

6. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。

7. 本产品只能用于科研

使用方法：

一、DNA 提取(样本制备区)

用自选方法提取纯化样品DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。

二、稀释标准曲线样品(样本制备区)

 （由于阳性对照浓度高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，避免污染样品或本试剂盒的其他成分）。

1. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

2.用带芯枪头分别加入45 μL DEPC-H2O，（最好用带芯枪头，下同）。

3.在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4.换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5.换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

若无需制作标准曲线，将阳性对照稀释到1×10E5拷贝/μL即可。

三、试剂配制(试剂准备区)

若有N个待检样品，准备N+2个qPCR管(N个待检样品+1个阴性对照+6个阳性对照)，向各PCR管中分别加入下列成分(见详细说明书，可向我司索取)

转移至样本准备区。

四、添加模板(模板添加区)

向qPCR管中分别加入2ul模板，加样顺序为阴性对照（DEPC-H2O）、待测样品模板、婴儿利什曼虫qPCR阳性对照，离心30秒，立即进行扩增反应。

五、扩增反应(扩增及产物分析区)

将PCR管放置在PCR扩增仪器样品槽相应位置，进行扩增，扩增程序如下：(见详细说明书，可向我司索取)

六、结果分析

1. 如果制作标准曲线，则以阳性对照浓度的log 值为横轴，以Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct 值从标准曲线上推算出样品DNA 浓度的log 值，推算出其浓度。

2. 如果未制作标准曲线，按照如下标准判定结果：

阳性对照结果：Ct 值<30，有明显指数增长，呈典型的S 型曲线。

阴性对照结果：Ct 值>38 或无Ct 值，无明显指数增长期和平台期。

样本检测结果：Ct 值<35，有明显指数增长，表明样本中检测出婴儿利什曼虫，结果为阳性；Ct 值>38 或无Ct 值，表明样本中未检测出婴儿利什曼虫，结果为阴性；Ct值在35-38 范围，应对样本进行复检，如重复实验结果Ct 值仍在35-38 范围，有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。

运输及保存：低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。阳性对照需要单独放置，不要污染其他试剂。

注意事项：

1所有操作严格按照说明书进行；

2试剂盒内各种组分使用前应自然融化，混匀并短暂离心；

3反应液应避光保存；

4反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；