石蜡切片免疫组化如何染色

实验材料

新鲜组织

试剂、试剂盒

二甲苯 酒精 H2O2 抗原修复液 枸橼酸钠缓冲液 石蜡 福尔马林 PBS DAB 苏木素 树胶 丙酮 打孔液 柠檬酸钠 APES 

仪器、耗材

恒温摇床 高压锅 塑料切片架 耐温玻璃容器 -80℃冰箱 恒冷冰冻切片机 载玻片

实验步骤

一．石蜡切片免疫组化染色实验步骤：

1．石蜡切片脱蜡至水：（石蜡切片染色前应置60℃ 1 小时）。

（1）二甲苯I、II,各10 分钟。

（2）梯度酒精：100%，2 分钟® 95%，2 分钟® 80%，2 分钟® 70%2 分钟。

（3）蒸馏水洗：5 分钟，2 次（置于摇床）。

2．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温10 分钟（避光）。

3．蒸馏水洗：5 分钟，2 次（置于摇床）。

4．抗原修复：

根据待检测的抗原，选择适当的方法。

附：抗原修复液（10mM pH 6.0 枸橼酸钠缓冲液）的配制

（1）储备液的配制：

A 液：枸橼酸三钠-2H2O 29.41g + 蒸馏水1000ml

B 液：枸橼酸21g + 蒸馏水1000ml

（2）工作液的配制：A 液82ml + B 液18ml + 蒸馏水900ml

抗原修复的方法：

（1）高压锅处理技术：枸橼酸钠缓冲液（10mM，PH6.0）,淹没切片,盖上锅盖，高压锅内煮沸,上汽3 分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）。

（2）微波处理技术:用塑料切片架,置于塑料或耐温玻璃容器内，枸橼酸钠缓冲液淹没切片，选择中高或高档,5 分钟;取出并补充已预热的枸橼酸钠缓冲液；再选择中高或高档,5 分钟（. 最佳温度为92～95℃）

（3）酶消化处理：此略。

抗原修复的注意事项：

（1）组织不能干。

（2）选择抗原修复方法要因抗体而异。

（3）该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。

（4）抗原修复后至DAB 显色的过程中，均需用PBS 缓冲液。

5．PBS：5 分钟，2 次（置于摇床）。

6．正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分（保持组织呈湿润状态）,滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15 分钟。