多克隆抗体的纯化方法有哪些

多克隆抗体的纯化方法主要依据抗体的理化性质（电荷、分子量、特异性结合能力）设计，常用的有粗纯化方法（盐析法）和精细纯化方法（亲和层析、离子交换层析等），具体如下：

1. 盐析法（硫酸铵沉淀法）—— 粗纯化

原理：中性盐（常用硫酸铵）会破坏蛋白质的水化膜，并中和其表面电荷，使抗体（主要是 IgG）因溶解度降低而沉淀析出；IgG 在硫酸铵饱和度 33%~50% 时可高效沉淀，而血清白蛋白等杂蛋白需更高饱和度才会沉淀，借此实现初步分离。

操作要点：

向血清中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，使最终饱和度达到 40%~50%；

4℃静置 1~2 小时，3000rpm 离心 15 分钟收集沉淀；

用 PBS（磷酸缓冲盐溶液）溶解沉淀，再通过透析或脱盐柱去除盐离子，得到粗提抗体。

优缺点：

✅ 优点：操作简单、成本极低、能大程度保留抗体活性，适合大规模粗纯化；

❌ 缺点：纯度低（含白蛋白、杂免疫球蛋白等），仅作为后续精细纯化的前处理。

2. 亲和层析法 —— 高特异性纯化

这是常用的精细纯化方法，利用抗体的特异性结合特性分离，分为两种类型：

（1）抗原亲和层析

原理：基于抗原 - 抗体的特异性免疫结合（锁钥匹配），将纯品抗原偶联到层析介质（如琼脂糖凝胶）上，血清过柱时，只有目标抗体能与柱上抗原结合，杂蛋白直接流出；再用洗脱液（低 pH 缓冲液、高盐溶液或抗原竞争液）将抗体洗脱下来。

操作要点：

抗原需高度纯化（纯度＞95%），否则会引入杂蛋白；

洗脱时用 pH 2.5~3.0 的甘氨酸缓冲液（温和洗脱），洗脱后立即用 Tris 缓冲液中和 pH，防止抗体变性。

优缺点：

✅ 优点：纯度高（特异性强），可直接获得针对目标抗原的抗体；

❌ 缺点：抗原制备成本高，仅适用于单一抗原的抗体纯化，通用性差。

（2）Protein A/G 层析

原理：Protein A（金黄色葡萄球菌来源）、Protein G（链球菌来源）能特异性结合 IgG 的 Fc 段（抗体恒定区），且不同物种 IgG 的结合效率不同（Protein A 优先结合兔、人 IgG；Protein G 结合小鼠、山羊 IgG 范围更广）。

操作要点：

将 Protein A/G 偶联到层析柱，血清过柱后 IgG 吸附在柱上；

用 pH 2.7~3.0 的洗脱液洗脱，中和后收集抗体。

优缺点：

✅ 优点：通用性强（无需制备抗原）、操作简便、纯度可达 90% 以上；

❌ 缺点：仅对 IgG 类抗体有效（IgM、IgA 不结合），不同物种抗体回收率差异大。

3. 离子交换层析 —— 精细纯化（去除杂蛋白）

原理：利用抗体与杂蛋白的电荷差异分离（抗体的等电点约为 5.8~7.3）：当溶液 pH 高于抗体等电点时，抗体带负电，可结合阴离子交换树脂（如 DEAE - 纤维素）；pH 低于等电点时带正电，结合阳离子交换树脂（如 CM - 纤维素）。通过梯度盐溶液洗脱，电荷差异大的杂蛋白先被洗脱，抗体后洗脱。

操作要点：

盐析或亲和层析后的抗体样品需透析至低离子强度缓冲液，再上柱；

用 0~1mol/L 的 NaCl 梯度洗脱，收集含抗体的洗脱峰。

优缺点：

✅ 优点：可去除残留杂蛋白（如白蛋白、降解片段），进一步提升纯度；

❌ 缺点：需优化缓冲液 pH 和离子强度，操作较繁琐，分辨率受样品复杂度影响。

4. 疏水作用层析 —— 辅助纯化

原理：蛋白质表面存在疏水基团，高盐条件下疏水作用增强，抗体可结合疏水层析介质（如苯基琼脂糖）；降低盐浓度时，疏水作用减弱，抗体逐步洗脱，杂蛋白（疏水性不同）则在不同盐浓度下分离。

操作要点：盐析后的样品可直接上柱（高盐环境），用低盐梯度洗脱，收集抗体峰。

优缺点：

✅ 优点：能去除疏水性杂蛋白，与离子交换层析互补；

❌ 缺点：需优化盐浓度，部分抗体可能因疏水结合导致活性损失。