原代细胞培养、复苏及无菌操作过程

原代细胞的培养

原代细胞的培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把di一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。 [1] 常用的原代细胞的培养有组织块培养和分散细胞培养。组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。分散细胞培养大致步骤为：将动物组织从机体中取出离散成单个细胞(常用胰蛋白酶)，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖(注意整个过程无菌)。

原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。由于细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。利用此方法还可直接服务于临床实践。例如，用从手术中切除的肿瘤细胞进行原代培养，然后用该培养细胞进行抗癌药物的筛选，根据肿瘤细胞对加入的化疗药物的敏感性来帮助选择有效的化疗方案，有可能起到增强疗效、降低副作用的作用。

原代细胞的复苏

1.取出细胞，迅速放入37℃温水中快速解冻。

2.吸出细胞悬液，并加10倍以上培养液。

3.用培养液适当稀释后接种培养瓶，放入37℃ CO2 培养箱静置培养。

原代细胞的培养其实与细胞系的培养无多大差别，针对不同的细胞会选择不同的细胞培养液。

1.培养液选择 

根据不同的细胞类型和实验 要求进行培养液的选择，常用的L/H DMEM, F12 DMEM, RPMI 1640。

加液：培养液不能浸没组织块，避免组织漂浮。然后培养4h左右加培养液，培养48h后换液。

a.培养时间

无论是酶消化法还是组织块法，取样后培养时间最少需要一周以 上的时间，期间可换液或者传代。

b.换液时间

无论酶消化法还是组织块法，在培养期间需要随时关注细胞的生长状况，需观察其是否贴壁，是否污染，组织块法要观察是否有细胞迁移出来。正常情况下48~72h可换液一次。

2.细胞状态判断

正常贴壁细胞在培养几天后，会逐渐贴满整个瓶底或者皿底，有的呈纤维状，有的呈多边形。下图均为比较健康的原代

原代细胞的传代、保存

传一代后的细胞(也可以不传代直接冻存)培养至80%~90%便可冻存起来供后续实验用。

冻存液配制:不同的细胞可能会有不同的冻存液配制方案，各实验室也有自己的冻存方案，常见的方案有:

A: 10%DMSO+90%FBS

B: 10%DMSO+40%FBS+50DMEM

C: 5%DMS0+45%DMEM+50%FBS 

按下列顺序降温：室温→4℃(20分钟)→冰箱冷冻室(30分钟)→超低温冰箱(-80℃ 过夜)→液氮。

D：无血清冻存液

传代：依椐细胞的生长状态，生长的细胞1：2或1：3进行传代。

细胞培养过程无菌操作

正常的复苏，换液和传代操作，最后将培养好的细胞进行相应的实验即可