PCR 假阴性（无扩增条带）如何快速排查

PCR 假阴性（无扩增条带）快速排查清单（实验室直接可用）

第一步：先看 3 个对照，定位大方向

阳性对照：无条带 → 试剂、程序、仪器、配体系问题

阴性对照：无条带 → 无污染，可排除污染干扰

样本孔：wei独样本无条带 → 模板本身问题（降解 / 浓度低 / 有抑制物）

第二步：试剂与体系排查（对照无条带优先查）

 Taq 酶是否过期、是否室温放置失活

 是否漏加：酶、Buffer、Mg²⁺、dNTP、引物

 Mg²⁺浓度是否偏低

 试剂是否反复冻融、反复开盖污染

 体系配制是否在冰上操作

第三步：引物排查

 引物是否过期、降解、稀释后久放

 退火温度是否过高（最易不出条带）

 引物有无发夹、二聚体、与模板不匹配

 更换新引物重试

第四步：模板核酸排查（样本无条带重点查）

 核酸是否降解（反复冻融、放置过久）

 模板浓度过低、上样量太少

 样本含抑制物：酚、乙醇、高盐、血红蛋白、肝素等

 处理方式：模板1:5~1:10 稀释后重扩

 重新提取新鲜核酸

第五步：PCR 扩增程序 & 仪器

 退火温度偏高 → 做温度梯度下调摸索

 起始变性温度 / 时间不足，双链未解链

 仪器孔位温度漂移，换孔 / 换仪器验证

第六步：电泳及人为操作

 琼脂糖凝胶浓度配制错误

 电泳时间、电压不合适

 核酸染色不充分、上样量过少

 加样顺序错误、交叉污染、配体系算错体积

第七步：标准解决操作流程

先跑阳性对照，区分试剂问题还是模板问题

退火温度做梯度 PCR

样本模板稀释后重新扩增

换新酶、新引物、重新提核酸

核对 PCR 程序参数，必要时微调变性、退火时间