小鼠骨髓中性粒细胞分离的常用方法整理

方法概述

小鼠骨髓中性粒细胞分离常用的是密度梯度离心法（Percoll 或 Histopaque 梯度）‍。骨髓是比外周血、腹腔更便捷且数量更充足的中性粒细胞来源。与免疫磁珠分选相比，密度梯度法更快速、经济，且可避免抗体标记引起的中性粒细胞激活。

基本步骤（密度梯度离心法）‍

1骨髓单细胞悬液制备：处死小鼠（常用8-12周龄C57小鼠），无菌提取股骨和胫骨，剪去两端软骨露出骨髓腔，用1mL无菌注射器吸取含10%胎牛血清的稀释液/PBS冲洗骨髓腔，制备成2×10⁸-1×10⁹/ml的骨髓单细胞悬液。

2梯度离心：可采用 Histopaque-1077 + Histopaque-1119 双层梯度，或 Percoll（如55%、65%、75%）梯度。双梯度法较常用：先在离心管加入试剂A（如1119）下层，再叠加试剂C（如1077）形成梯度界面，将细胞悬液平铺其上。

3离心：室温、水平转子，离心力与时间视体系而定——反馈资料中常用800g离心30min，试剂盒说明建议500-1000g离心20-30min（最大不超过1200g）。

4收集细胞层：离心后出现两层环状乳白色细胞层，上层为单个核细胞，下层（试剂C与试剂A之间及试剂A中）为中性粒细胞层，小心吸取。

5洗涤/裂红：如混有红细胞可加入红细胞裂解液；用PBS或洗涤液250g离心10min洗涤。

6重悬计数：重悬细胞并计数备用。

纯度与活力

基于密度梯度离心的方案通常可获得高纯度（80-95%）且高活力（>95%）‍ 的中性粒细胞。不过有实验者反馈，实际操作中单只小鼠获量可能少于1×10⁶、纯度约80%，与文献报道（总量约6×10⁶、纯度95%以上）存在差距。

鉴定与质控

分离后的中性粒细胞可通过表面标志物Ly6G（免疫荧光法/流式检测）进行鉴定，也可经PMA刺激后检测髓过氧化物酶（MPO）释放来验证功能活性。

注意事项（要点）‍

全程严格无菌操作。

分离液与样本需平衡至室温（18-25℃）；低温离心可能加重红细胞污染。

稀释/洗涤细胞时不可使用含Ca、Mg离子的缓冲液，否则会导致细胞凝集、降低得率与纯度。

若需进一步培养，注意无菌操作避免污染。

离心转速大小、时间长短、细胞密度都会影响分层效果（目的细胞残留血浆层往往是转速过小/时间过短；残留在分离液内往往是转速过大/时间过长），需按实验条件摸索优化。

其他方法

除密度梯度法外，还可采用正向免疫磁珠选择或流式分选（FACS）‍ 直接从组织分离高纯度中性粒细胞；对于JI高纯度需求，密度梯度分离后也可配合免疫磁珠分选进一步纯化