巨噬细胞提取与培养指南(超全步骤）

巨噬细胞提取与培养全指南

一、实验目的与应用场景

巨噬细胞是固有免疫系统的核心细胞，参与吞噬、抗原呈递、炎症调控及组织稳态维持。提取并培养原代巨噬细胞，常用于研究病原体感染、肿瘤微环境、药物免疫调节、炎症信号通路等。常见来源包括小鼠腹腔、骨髓、肺泡、外周血单核细胞以及人外周血单核细胞。本指南以zui常用的小鼠腹腔巨噬细胞和骨髓来源巨噬细胞（BMDM）为核心，并补充人源单核细胞来源巨噬细胞的方案。

二、实验前准备

1. 动物或细胞来源

    小鼠腹腔巨噬细胞：6~10周龄C57BL/6或BALB/c小鼠，优先选用SPF级。

    骨髓来源巨噬细胞：同一品系小鼠，取股骨和胫骨。

    人外周血单核细胞：健康供体外周血或白膜层（buffy coat），需伦理审批。

2. 试剂与耗材

    基础培养基：RPMI-1640或DMEM（高糖）。

    胎牛血清（FBS）：建议使用低内毒素级别，终浓度10%。

    青霉素-链霉素（100×）：终浓度1%。

    巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）：重组小鼠或人M-CSF，工作浓度10~20 ng/mL（BMDM或单核细胞分化）。

    硫乙醇酸盐培养基（Thioglycollate）：用于诱导小鼠腹腔巨噬细胞（3%无菌溶液，每只小鼠腹腔注射1 mL）。

    红细胞裂解液（ACK）、PBS（无钙镁）、70 μm细胞筛、10 cm培养皿、6孔板、T75培养瓶、无菌注射器、离心管等。

    细胞消化液：Trypsin-EDTA（0.25%）或细胞刮刀（巨噬细胞贴壁牢固，刮刀更温和）。

3. 设备

    生物安全柜、CO₂培养箱、离心机、倒置显微镜、细胞计数仪。

三、核心操作流程

方案A：小鼠腹腔巨噬细胞提取（诱导法）

    诱导：向小鼠腹腔注射1 mL无菌3%硫乙醇酸盐培养基（或1 mL 4%淀粉肉汤），诱导无菌炎症，使巨噬细胞富集至腹腔。

    收集时间：注射后3~4天（巨噬细胞数量达到峰值），过量麻醉处死小鼠，75%乙醇浸泡消毒5分钟。

    腹腔灌洗：

        在超净台内，将小鼠仰卧固定，用镊子提起腹部皮肤，剪开小口并钝性剥离，暴露完整腹膜（勿剪破）。

        用10 mL注射器吸取8~10 mL预冷PBS（含2% FBS或1% BSA），从腹膜中下部刺入，注入腹腔。

        轻揉腹部1~2分钟，用同一注射器缓慢回抽灌洗液，重复灌洗2次，合并收集至15 mL离心管，置于冰上。

    细胞处理：

        离心：300×g，4℃，10分钟。

        弃上清，加入1 mL红细胞裂解液重悬沉淀，室温静置1~2分钟，加入10 mL PBS终止裂解。

        再离心（300×g，10分钟），弃上清，用完培（RPMI-1640 + 10% FBS + P/S）重悬计数。

        预期获得细胞总数：每只小鼠约1~3×10⁷个细胞，其中巨噬细胞占比约60%~80%（经硫乙醇酸盐诱导后）。

    贴壁纯化：

        将细胞以2×10⁶ cells/mL接种于培养皿，置于37℃培养箱中贴壁2~4小时。

        用预温PBS洗涤2次，洗去未贴壁的淋巴细胞及其他悬浮细胞，贴壁细胞即为巨噬细胞。

        加入新鲜完培继续培养。

方案B：小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）分化

    取材：

        处死小鼠后，75%乙醇浸泡5分钟，剪开后腿皮肤，分离股骨与胫骨，剔除肌肉组织，放入含PBS（加2% P/S）的培养皿中。

        用剪刀剪去骨骺两端，暴露骨髓腔。

    冲出骨髓细胞：

        用1 mL注射器吸取含2% FBS的PBS或完培，针头插入骨髓腔一端，反复冲洗骨髓至培养皿中，直至骨段变白。

        将所有骨髓悬液通过70 μm细胞筛，得到单细胞悬液。

    裂红与计数：

        离心（300×g，10分钟），弃上清，加入2 mL ACK裂解液，室温5分钟，加入10 mL培养基终止。

        离心计数，预期每只小鼠可获得约5~8×10⁷个骨髓细胞。

    分化培养：

        用含10 ng/mL M-CSF的完培重悬细胞，以1×10⁶ cells/mL密度接种于10 cm培养皿（每皿10 mL）或6孔板（每孔2 mL）。

        置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。

        第3天：弃去半量培养基（含悬浮细胞），补充新鲜含M-CSF培养基。

        第5~7天：细胞逐渐分化为贴壁的成熟巨噬细胞，表现为梭形或星形，有伪足。第7天收获使用。

        收获时弃培养基，用预冷PBS洗1遍，加入少量Trypsin-EDTA消化1~2分钟，或直接用细胞刮刀刮取，终止后离心备用。

方案C：人外周血单核细胞来源巨噬细胞

    分离PBMC：

        将外周血或白膜层用PBS等体积稀释，缓慢加至Ficoll-Paque密度梯度液面上（血:PBS:Ficoll比例约4:4:3），保持界面清晰。

        离心：400×g，20~30分钟，升速慢，降速为0（室温，18~20℃）。

        吸取白膜层（PBMC），用PBS洗涤2次（300×g，10分钟），计数。

    单核细胞分离（可选）：

        用CD14磁珠（MACS）阳性分选，获得高纯度单核细胞；或利用单核细胞贴壁特性：将PBMC接种于培养皿，37℃贴壁1~2小时，洗去悬浮淋巴细胞，贴壁细胞即单核细胞。

    巨噬细胞分化：

        用含50 ng/mL人M-CSF的完培培养，细胞密度约1~2×10⁶ cells/mL。

        培养6~8天，每2~3天半量换液，补足M-CSF。

        收获时同上，得M0型巨噬细胞，可根据实验需要进一步极化为M1或M2型。

四、巨噬细胞的鉴定与纯度检测

    形态特征：贴壁培养时呈梭形或多边形，胞质丰富，有伪足；活细胞可观察到吞噬小泡。

    流式细胞术：

        小鼠巨噬细胞标记：F4/80、CD11b、Mac-3；M1型为CD86、MHC-II；M2型为CD206、Arg-1。

        人巨噬细胞标记：CD14、CD68（胞内）、CD11b；M1为CD80、CD86；M2为CD163、CD206。

    吞噬功能检测：用荧光标记的E.coli或荧光珠（FITC-dextran）孵育巨噬细胞，通过荧光显微镜或流式检测吞噬率。

    NO分泌测定：用LPS（100 ng/mL）刺激巨噬细胞，18~24小时后取上清，用Griess试剂检测亚硝酸盐含量。

五、培养常见问题与对策

| 问题 | 可能原因 | 解决方案 | |---|---|---| | 细胞贴壁不牢或大量死亡 | 操作中反复吹打过度、胰酶消化时间过长、血清质量差 | 使用预温培养基，轻柔操作；换用优质低内毒素血清；接种后24小时内勿动 | | 培养中细胞变形分裂异常 | M-CSF浓度不足或活性丧失 | 分装冻存M-CSF，避免反复冻融；提高浓度至20 ng/mL | | 来源细胞污染成纤维细胞 | 骨髓取材时附带肌肉/骨膜组织 | 仔细剔除肌肉；使用细胞筛过滤；骨髓腔冲洗时勿刺破骨皮质 | | 诱导效果差（腹腔法巨噬细胞少） | 硫乙醇酸盐注射量不足或时间过短 | 确保每只小鼠注射1 mL，3%浓度；时间严格控制在3~4天 | | 细胞开始漂浮并聚团 | 巨噬细胞过度活化（如内毒素污染）、培养过密 | 严格无菌操作，避免LPS污染；降低接种密度或及时换液 | | 人单核细胞不贴壁 | Ficoll分离时间过短、细胞活性差 | 确保离心时升降速度缓慢；用新鲜血液；贴壁时使用含人AB血清的培养基 |

六、巨噬细胞的极化和功能实验（简要）

    M1极化：用LPS（100 ng/mL）+ IFN-γ（20 ng/mL）刺激18~24小时，检测TNF-α、IL-6、iNOS表达。

    M2极化：用IL-4（20 ng/mL）+ IL-13（20 ng/mL）刺激18~24小时，检测Arg-1、CD206、Ym1表达。

    吞噬实验：加入pHrodo荧光标记的酵母颗粒或凋亡细胞，孵育30~60分钟，流式检测吞噬比例。

    杀伤实验：与肿瘤细胞共培养，通过LDH释放评估巨噬细胞杀伤活性。

七、注意事项

    所有操作均在生物安全柜中进行，使用无菌耗材。

    巨噬细胞是终末分化细胞，不增殖（在无M-CSF条件下），培养过程中数量会逐渐减少，实验需一次性分好足够数量。

    若需长期保存，可将原代巨噬细胞冻存于含10% DMSO的胎牛血清中，但复苏率较低，建议尽量新鲜使用。

    不同品系小鼠（如BALB/c vs C57BL/6）对诱导剂反应有差异，实验前可预实验确定最佳条件。

    人源巨噬细胞培养时，避免FBS引起的非特异性活化，可使用人血清或无血清培养基。

八、总结

巨噬细胞的提取与培养，核心在于“温和操作、严格控制活化、提供合适的分化信号"。腹腔法适合快速获取大量成熟巨噬细胞，BMDM法适合需要高纯度、可批量分化的场景，人外周血单核细胞分化则用于转化研究。成功提取后，务必通过形态、表面标志物及功能实验确认细胞身份，才能保证后续实验可靠。

如果你需要针对某种特定来源（如肺泡巨噬细胞或肿瘤相关巨噬细胞）的方案，可进一步提问，雅吉生物会提供相应细节。