ATCC细胞系使用指南

　　ATCC是全球zui quan威的生物资源库之一，规范地使用其细胞系是保证科研数据可靠性和可重复性的基础。

细胞的复苏

　　核心原则：“慢冻快融"。

　　准备：提前预热完培（含胎牛血清FBS和抗生素，视细胞需求而定）。准备好15mL离心管并加入5-9mL预热培养基。

　　水浴融化：从液氮罐中取出冻存管，立即投入37°C恒温水浴锅中，轻轻摇晃并在1-2分钟内使其wan全融化（留一小块冰晶未融亦可，以保持细胞完整性）。

　　离心洗涤（可选但推荐）：将融化的细胞悬液移入装有预热培养基的离心管中，1000rpm离心3-5分钟，弃上清（去除DMSO冻存液的毒性），用新鲜培养基重悬。

　　注：对于极其脆弱的细胞，可不离心，直接将细胞悬液滴入培养瓶中，待细胞贴壁后（约次日）再换液。

　　接种培养：将重悬的细胞移入培养瓶/皿中，补充至所需体积，十字交叉法轻轻摇匀，放入37°C、5%CO₂培养箱中。

日常培养与传代

　　核心原则：保持细胞处于对数生长期，避免过度生长。

　　观察：每天在倒置显微镜下观察细胞形态、密度及是否有污染（细菌、真菌或支原体）。

　　传代时机：当贴壁细胞达到80%-90%汇合度，或悬浮细胞达到最大推荐密度时，需进行传代。

　　传代步骤（以贴壁细胞为例）：

　　吸弃旧培养基，用无菌PBS洗涤细胞1-2次（去除血清中的胰酶抑制剂）。

　　加入适量胰蛋白酶-EDTA溶液（刚好覆盖底面即可），放入培养箱中消化1-5分钟（视细胞类型而定）。

　　显微镜下观察到细胞变圆、边缘开始脱离器皿时，轻轻拍打瓶壁使细胞脱落。

　　加入等量或双倍的完培（利用血清中和胰酶），吹打底部制成单细胞悬液。

　　移入离心管离心，弃上清，用新鲜培养基重悬。

　　按ATCC推荐的传代比例（如1:3,1:5,1:10）接种到新的培养器皿中。

细胞的冻存

　　核心原则：“慢冻"，避免冰晶损伤细胞。

　　冻存时机：选择对数生长期、活力>90%且无污染的细胞。

　　冻存液配制：通常为90%胎牛血清(FBS)+10%DMSO，或基础培养基+10%FBS+10%DMSO。注意：DMSO在室温下对细胞有毒性，配制后需置于冰上预冷。

　　操作步骤：

　　按常规方法消化、离心收集细胞。

　　用预冷的冻存液重悬细胞，调整密度至1×10⁶~5×10⁶cells/mL。

　　将悬液分装入无菌冻存管（约1mL/管），拧紧盖子。

　　使用**程序降温盒（Mr.Frosty）**放入-80°C冰箱，使其以约-1°C/分钟的速度缓慢降温。（若无降温盒，可采用棉塞包裹冻存管悬挂于液氮罐口法）

　　24小时后，将冻存管从-80°C转移至**液氮罐（-196°C）**中长期保存，并做好详细记录（细胞名称、代次、日期、操作人）。

质量控制与常见避坑指南

　　警惕支原体污染：

　　支原体污染不会使培养基变浑浊，但会严重影响细胞代谢、基因表达和实验结果。

　　建议：新收到的细胞或每隔1-2个月，定期使用PCR法或DAPI/Hoechst染色法进行支原体检测。

　　切勿过度传代：

　　正常细胞（如成纤维细胞）存在海弗里克极限，会随着传代衰老死亡。

　　肿瘤细胞虽然“永生"，但长期传代会导致基因型漂移、形态改变和药物敏感性变化。

　　建议：收到ATCC细胞后，立即进行扩增并冻存多管“早期代次"的种子库（MasterCellBank），日常实验从种子库复苏，传代控制在20-30代以内废弃。

　　严格遵循培养基配方：

　　不要轻易替换ATCC推荐的培养基。例如，某些细胞需要特定浓度的丙酮酸钠、非必需氨基酸或特殊的生长因子。随意换液可能导致细胞表型丢失。

　　生物安全：

　　严格按照ATCC标注的生物安全等级（BSL-1或BSL-2）在相应的生物安全柜内操作。

　　涉及人类或灵长类来源的细胞系，务必做好防护并遵守实验室生物安全规定。

　　规范使用ATCC细胞系，不仅能提升实验的成功率，更是发表高水平学术论文、通过同行评审的基础保障。