一文读懂荧光定量PCR（qPCR）：从原理、荧光染料到Ct值

　　一、核心原理：实时监测与定量分析

　　qPCR在传统PCR基础上引入荧光标记系统，通过实时监测每个循环的荧光信号强度，实现扩增产物的动态跟踪。当荧光信号达到预设阈值时，所经历的循环数即为Ct值（CycleThreshold）。由于Ct值与起始模板量呈负相关（模板量越多，Ct值越小），结合标准曲线可实现绝对定量或相对定量分析。例如，在疾病诊断中，通过检测病原体核酸的Ct值，可判断感染程度；在基因表达研究中，比较不同样本的Ct值差异，可分析基因表达水平。

　　二、荧光标记体系：染料法与探针法

　　染料法（SYBRGreenI）

　　SYBRGreenI是一种嵌入型荧光染料，可非特异性结合双链DNA（dsDNA）。在游离状态下，染料荧光微弱；与dsDNA结合后，荧光强度增强1000倍。该方法操作简便、成本低，但无法区分特异性产物与非特异性扩增（如引物二聚体），需通过熔解曲线分析验证产物特异性。

　　探针法（TaqMan探针）

　　TaqMan探针为寡核苷酸链，5’端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭基团。探针完整时，报告基团荧光被淬灭；PCR扩增时，Taq酶的5’→3’外切酶活性切割探针，释放报告基团，荧光信号与产物量同步累积。该方法特异性强（需引物与探针双重匹配）、灵敏度高（可检测单拷贝基因），且支持多重检测（通过不同荧光标记区分多个靶基因）。

　　三、Ct值：定量分析的核心参数

　　Ct值是qPCR结果解读的关键指标，其大小直接反映起始模板量。例如，在肿瘤标志物检测中，若患者样本中某基因的Ct值显著低于健康人群，可能提示基因过表达，与肿瘤发生相关。此外，Ct值还可用于评估实验效率：标准曲线斜率接近-3.32时，扩增效率达100%；若斜率偏离，需优化反应条件（如引物浓度、退火温度）。

　　四、应用场景与优势

　　qPCR广泛应用于疾病诊断（如新冠病毒检测）、基因表达分析、转基因检测及SNP分型等领域。其核心优势包括：

　　高灵敏度：可检测单拷贝基因；

　　高特异性：探针法通过双重匹配确保结果准确；

　　实时定量：无需电泳等后处理步骤，避免交叉污染；

　　宽动态范围：可覆盖5-6个数量级的模板浓度。

　　从原理到应用，qPCR以荧光信号为“量尺”，为生命科学研究与临床诊断提供了精准、高效的核酸定量工具。