免疫PCR实验方法原理

实验方法原理

主要由两个部分组成，第一部分的免疫反应类似于普通的酶联免疫吸附试验（ELISA）的测定过程；第二部分即通常的PCR检测，抗原分子的量最终由PCR产物的多少来反映。第一步中，首先用待测抗原（如牛血清白蛋白（ESA））包被微滴板孔，再加入相应的特异抗体，于是抗体就与固相上的抗原结合形成抗原抗体复合物，蛋白A-链亲合素（Protein A-Streptavidin）嵌合体（重组融合蛋白）中的蛋白A部分可与固相上抗原抗体复合物中的抗体IgG结合，而链亲合素部分可与生物素化的pUC19（质粒DNA) (Biotin-pUC19）中的生物素反应，从而将特定的DNA间接吸附于固相。接下来，就是第二步中的PCR过程，第一步中吸附于固相的pUC19质粒DNA在相应的引物存在下，可经PCR在几小时内而放大数百万倍，PCR产物的多少与固相上抗原的量成正比。

PCR由以下五部分构成：

（1）待测抗原；

（2）生物素化抗体；

（3）亲和素（连接分子）；

（4）生物素化DNA；

（5）PCR扩增。

主要程序：

（1） 抗原+生物素化抗体→抗原-生物素化抗体复合物；

（2） 加亲合素→抗原-生物素化抗体-亲合素复合物；

（3） 加生物素化DNA→抗原-生物素化抗体-亲合素-生物素化DNA；

（4） PCR扩增生物素化DNA部分。

实验材料抗原样品

试剂、试剂盒包被缓冲液洗涤液稀释液琼脂糖凝胶

仪器、耗材微滴板电泳仪电泳槽

实验步骤

一、制备生物素化DNA

 将噬粒 BLuescript skt，用生物素标记的M13引物进行PCR扩增制备出含T3和T7引物序列的280 bp DNa段，即为生物素化DNA。

二、免疫PCR模式

 1.  试剂

 包被缓冲液：20 mmol/L Tris-HCI（pH9.5），含150 mmol/L NaCl和0.02%NaN3；

 洗涤液：20 mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150 mmol/LNaCl 0.1 mmol/L EDTA和0.1%Tween20；

 稀释液：20 mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150 mmol/L NaCl 0.45%脱脂奶及变性鲑鱼精DNA （0.1 mg/ml）。

2.  操作

 1） 包被

 用包被缓冲液稀释抗原（BSA），加入微滴板中（45 μl孔），4℃过夜（约15 h），用洗涤液洗板3次×5 min。

 2） 封闭

 每孔加200 μl含4.5%脱脂奶及变性鲑鱼精子DNA（1 mg/ml）、0.1 mmol/L EDTA的20 mmol/L Tris-Hcl（pH7.5）（含150 mmol/L NaCl缓冲液，37℃温育80 min，洗板数次。

 3） 抗原抗体反应

 用释释液1:8 000稀释单克隆抗BSA抗体，每孔加50 μl，室温（22℃）下45 min，洗板孔15次×10 min，去除未结合的抗体分子。

 4） 链亲合一蛋白A结合反应

 每孔加入50 μl用稀释液稀释的已与生物素-pUC19结合的链亲合素-蛋白A嵌合体，室温（22℃）50 min，使得嵌合体-pUC19结合于固相的抗原抗体复合物上，然后洗板15次×10 min，再用无NaN3的TBS洗3次，然后即可将微滴板用于后面的PCR反应。

 5） PCR

 实验条件 50 mmol/L KCI、10 mmol/L Tris-HCI（20℃pH8.3）、1.5 mmol/LMgCl2、明胶（10 μg/ml）、0.8 mmol/LdNTPs（每种0.2 mM）、2 μM引物（每一引物1 μM）和TaqDNA多聚酶（50 U/ml）。

三、PCR周期

 PCR前，用紫外线（UV）（254 nm）照射上述反应混合物，然后将之加入到微滴板孔中，每孔40 μl，再加20 μl UV照射的石蜡覆盖，按下述温度在PCR仪上进行PCR周期：起始变性94℃5 min；30个周期：变性94℃5 min，退火58℃1 min，延伸72℃1 min，最后延伸72℃ 5 min，得到的PCR产物为特定的261 bp的片段。

 1.  用0.85% NaCl将细菌溶液稀释至一定浓度；

 2.  加50 μl于微孔板内，4℃过夜。同时设阴性对照（加50 μl 0.85% NaCl于另一孔内）；

 3.  用400 μl的0.05% 温20pBS（以下简称TPBS），洗涤五次；

 4.  加入2.25%的100 μl正常山羊血清（NGS） PBS封闭2小时； 

⒌  用含0.15% NGS的TPBS洗3次；

6.  加入100 μl用0.75% NGS适当稀释的单克隆抗体（内含100 μg的鲜鱼精DNA），室温孵育30 min；

7.  用TPBS洗涤五次；

8.  加入50 μl适量稀释的生物素化抗鼠IgG抗体，室温孵育30 min；

9.  用TPBS洗涤五次；

10.  加入60 μl适量稀释的生物素化DNA和亲和素，室温孵育30 min；

11.  用TPBS洗涤五次，再用HPLC级水洗三次；

12.  PCR扩增：加入50μl PCR反应液（内含T3和T7引物），95℃ 60 s，50℃ 110 s，72℃ 110 s，循环30次。取PCR产物10 μl于1.7%琼脂糖凝胶上电泳，和核酸分子量标准相比较，在相应的位置邮现电泳带为阳性。必需时将电泳结果照像，进行定量分析。