ELISA试剂盒操作手册——实验操作过程不踩雷

ELISA 试剂盒完整手册（含运输、保存、原理、操作、进口注意事项，ATCC 细胞配套实验）

一、核心原理

基于抗原 - 抗体特异性结合+HRP/AP 酶信号放大，TMB 底物显色，酶标仪 450nm 测 OD 值定量，显色深浅与待测物浓度正相关（竞争法相反）。

四种ELISA原理示意图

4 种主流试剂盒分型

双抗体夹心法（科研zui常用，大分子蛋白：细胞因子、蛋白、激素）

预包被捕获抗体→结合样本抗原→生物素检测抗体→链霉亲和素 HRP 显色；灵敏度高、特异性好，血清 / 细胞上清 / 组织匀浆通用。

竞争法（小分子：激素、药物、毒素、短肽＜1kDa）

样本抗原与酶标抗原竞争有限结合位点，浓度越高颜色越浅。

间接法（检测抗体：血清 IgG、自身抗体）

抗原包板，样本一抗结合，酶标二抗显色。

直接法：步骤少、灵敏度低，极少商品化试剂盒。

二、试剂盒标准组分（96T 可拆板）

预包被酶标板（可拆卸条板，未用wan密封冷藏）

冻干标准品、标准品稀释液

样本稀释液、生物素化检测抗体浓缩液

HRP 亲和素浓缩液、浓缩洗涤液

TMB 显色液 A/B、终止液（2M H₂SO₄）

封板膜、说明书、COA 质检报告

三、ELISA 试剂盒运输规范（进口 / 国产通用，重点）

1. 温控标准（绝大多数科研试剂盒）

常规款：全程 2–8℃冷链运输（蓝冰 / 相变冰袋）

酶标抗体、包被板、标准品遇常温高温易蛋白变性，灵敏度暴跌、背景升高。

高敏感组分（部分进口试剂盒）：-20℃干冰运输

冻干标准品、高浓度生物素 - HRP 需防冻融，长途国际件用干冰保温箱。

禁止：冰袋直接贴试剂瓶（局部结冰导致试剂失效）；夏季暴晒、快递柜常温存放。

2. 包装方案

短途 1–2 天：加厚泡沫箱 + 蓝冰，冰重≈试剂盒 1 倍；

跨省 3–4 天：相变冰袋 + 双层保温；

国际进口（如 R&D、Thermo、Abcam）：VIP 真空保温箱 + 足量干冰，内置温度记录仪追踪；

外层纸箱加固防挤压避光，贴生物试剂冷链标识。

3. 进口清关要点（和 ATCC 细胞配套采购）

ELISA 属于生物诊断试剂特殊物品：

科研用无需医疗器械证，但需实验室备案；

随货单据：产地证、COA、MSDS、商业发票；

无需 P2 实验室资质（区别于活细胞），清关更快；

四、收货查验与长期保存

收货检查

开箱确认保温箱内仍有冰，试剂无结冰、漏液、浑浊；

全程拍照录像，若冰wan全融化、试剂冻硬，立即联系供应商售后；

核对板数、试剂体积、标准品数量是否齐全。

储存条件（未开封 / 开封区分）

整盒未开封短期（6 个月内）：2–8℃冷藏

长期保存（12 个月）：分装后 - 20℃避光，避免反复冻融

开封后

1 周内用wan：全部 4℃；

超过 1 周：包被板、标准品、生物素抗体、HRP 放 - 20℃，缓冲液 / 洗涤液 4℃；

洗涤液低温结晶属正常，37℃水浴溶解后再用；

TMB 显色液避光保存，变蓝即失效，不可使用。

五、标准实验操作流程（夹心法通用 SOP）

试剂复温：试剂盒室温平衡 20–30min，浓缩洗涤液稀释备用；

标准品梯度配制：冻干标准品溶解，倍比稀释做 7 个梯度 + 空白孔；

加样：每孔 100μL 标准品 / 稀释样本，封板 37℃孵育 60min；洗板 3 次；

加生物素抗体：100μL / 孔，37℃孵育 30–60min，洗板 3–5 次；

加 HRP 亲和素：100μL / 孔，37℃孵育 30min，充分洗板；

显色：TMB 100μL，避光 37℃10–20min（肉眼可见蓝色梯度即停）；

终止读数：加终止液变黄，30min 内酶标仪 450nm 读数，推荐 540nm 校正波长；

数据计算：四参数拟合（4-PL）标准曲线，换算样本实际浓度。

六、常见实验问题排查

全板高背景：洗板不充分、孵育温度过高、试剂污染、封闭不足；

标准曲线无梯度：HRP/TMB 失效、抗体冻融失活、孵育时间不足；

OD 值偏低：样本降解、稀释倍数错误、冷链运输失效；

复孔 CV 值大：加样不均、板条漏液、孵育温差大。

七、配套 ATCC 细胞实验搭配建议

检测细胞上清细胞因子（IL-6、TNF-α、VEGF 等）优先选双抗体夹心高敏 ELISA；

细胞刺激后上清收集：1000g 离心 5min 取上清，分装 - 20℃冻存，避免反复冻融，检测前按试剂盒说明书稀释。